應用案例（質量光度計）：質量光度計在核酸方面的應用
應用案例（質量光度計）：質量光度計在核酸方面的應用
Mass photometry of nucleic acids
翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司
質量光度法可以定量測定溶液中生物分子的質量分布。它用于分析蛋白質的純度，表征他們的低聚態(tài)和定量他們的蛋白質-蛋白質相互作用是建立的。然而，它在表征其他生物分子(包括核酸)方面的應用研究較少。在這里，我們展示了如何使用質量光度法來測量100到5000個堿基對范圍內的DNA的質量、大小和豐度。
質量光度法(MP)是一種新的分析技術，它利用單個生物分子散射的光來測量它們的質量。在MP測量中，當分子遇到質量光度計覆蓋的玻璃-水界面時，檢測到溶液中單個分子散射的微量光。散射光的量與分子的質量成線性關系。因此，通過一個簡單的校準，不同種類分子的分子質量可以被精確地確定。
在這篇應用筆記中，我們概述了如何應用MP測量核酸，包括制備和校準的步驟。我們還展示了從低質量階梯到整個質粒的DNA測量示例。
核酸測量的準備工作
DNA和RNA在溶液中都帶負電荷，這意味著它們往往會被未處理的蓋玻片排斥。因此，核酸表現(xiàn)出很少和短暫的結合。這導致MP數(shù)據(jù)中很少且定義不明確的事件，解綁定的事件和綁定的事件一樣多(圖1)。
為了克服這種瞬態(tài)行為，覆蓋表面可以功能化成為帶正電荷的，增加它與帶負電荷的核酸的相互作用。為了實現(xiàn)這種功能化，玻璃表面可以用APTES2或聚賴氨酸(PLL)進行處理。
用鎖相環(huán)覆蓋在玻璃上大大增強了檢測能力，結合事件的數(shù)量顯著增加(解除結合的數(shù)量減少)(圖1)。低質量DNA ladder的所有6個組成部分，跨度從100到2000個堿基對(63 kDa 到1242 kDa)。這說明MP可以用來測量溶液中核酸的質量分布。
核酸質量校準
質量光度法(MP)是一種新的分析技術，它利用單個生物分子散射的光來測量它們的質量。在MP測量中，當分子遇到質量光度計覆蓋的玻璃-水界面時，檢測到溶液中單個分子散射的微量光。散射光的量與分子的質量成線性關系。因此，通過一個簡單的校準，不同種類分子的分子質量可以被精確地確定。
在這篇應用筆記中，我們概述了如何應用MP測量核酸，包括制備和校準的步驟。我們還展示了從低質量階梯到整個質粒的dna測量示例。
核酸測量的準備工作
DNA和RNA在溶液中都帶負電荷，這意味著它們往往會被未處理的蓋玻片排斥。因此，核酸表現(xiàn)出很少和短暫的結合。這導致MP數(shù)據(jù)中很少且定義不明確的事件，解綁定的事件和綁定的事件一樣多(圖1)。
圖1未處理與功能化玻璃上核酸的測量值。DNA階梯疊加在未處理(中藍色)和聚賴氨酸涂層(灰色/深藍色)玻璃上。分子質量(kDa)采用DNA校準，假設一個堿基對等于660 Da。
為了克服這種瞬態(tài)行為，覆蓋表面可以功能化成為帶正電荷的，增加它與帶負電荷的核酸的相互作用。為了實現(xiàn)這種功能化，玻璃表面可以用APTES2或聚賴氨酸(PLL)進行處理。
用鎖相環(huán)覆蓋在玻璃上大大增強了檢測能力，結合事件的數(shù)量顯著增加(解除結合的數(shù)量減少)(圖1)。低質量DNA ladder的所有6個組成部分，跨度從100到2000個堿基對(63 kDa)
1242 kDa)是很好的解決。這說明MP可以用來測量溶液中核酸的質量分布。
核酸質量校準
圖2 DNA與蛋白質校準比較。不同的核苷酸和氨基酸折射率導致不同的DNA和蛋白質校準曲線的斜率。這并不影響測量，但影響分析物分子質量的計算。
MP可應用于多種生物分子。然而，不同類型的分子的折射率不同。因此，為了正確地將測量的對比與分子質量相關聯(lián)，應該使用已知質量和與分析物相同分子類別的分子進行適當?shù)男省Σ煌肿宇悇e的標定均顯示出對比度和質量之間普遍的線性相關關系，但斜率不同(圖2)。
至于校準蛋白質的測量，可用的商業(yè)標準可用于校準DNA的測量。凝膠電泳的DNA階梯(1堿基對= 660道爾頓)的一次測量就足以進行準確的校準(圖2)。通過這些簡單的準備，MP可以用來測量未知成分的DNA樣品的質量(或堿基對的數(shù)量)。
測量核酸
為了證明MP測量對核酸的實用性，我們使用最小樣本(3 ng)確定了PCR產(chǎn)物的質量和均勻性。測量結果顯示，在218 kDa處有一個對稱峰，相當于331 bp(圖3)，與預期長度335 bp接近。
圖3 PCR產(chǎn)物驗證結果顯示其同源性。PCR產(chǎn)物的MP測定得到了分子量為218 kDa的單峰。用DNA標準曲線進行校正，長度為331 bp(預期長度為335 bp)。
為了測試更大的DNA物種是否能夠以同樣的精度進行分析，我們測量了質粒pUC18(圖4)。在2683 bp處觀察到豐富的峰，相當于1773 kDa。檢測到的DNA片段長度約為5000 bp，短于1000 bp。
圖4質粒的驗證顯示了質粒的異質性。質粒pUC18的MP測定顯示一個主峰，分子量為1773 kDa。使用DNA標準曲線進行校正，結果顯示完整質粒的長度為2683 bp(預期長度: 2686bp)。同時檢測到高、低質量的DNA種類。
這種測量突出了MP適用的寬質量范圍，以及測量的單分子性質所提供的高動態(tài)范圍。
綜上所述，MP是一種令人興奮的替代現(xiàn)有核酸定量技術。它允許使用非常少的樣品進行質量測定和純度評估，只需幾分鐘，并且不需要任何污漬。
北京佰司特科技有限責任公司
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