為了彌補(bǔ)動(dòng)物模型的局限性，提出了新的藥物安全性評(píng)估模型，以完善和減少現(xiàn)有的模型。為了在體外腸-肝臟的微生理系統(tǒng)（MPS）中模擬藥物的吸收和代謝，并預(yù)測(cè)藥代動(dòng)力學(xué)和毒性效應(yīng)，中國(guó)食品藥品檢定研究院安全評(píng)價(jià)研究所（國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，德國(guó)TissUse GmbH公司的科學(xué)家一起合作，建立了一個(gè)腸-肝臟串聯(lián)培養(yǎng)芯片，檢測(cè)了APAP（對(duì)乙酰氨基酚）過(guò)量后的急性肝臟損傷過(guò)程，并于2024年9月發(fā)表于《Food and Chemical Toxicology》雜志。

使用 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細(xì)胞系建立了腸類(lèi)器官，同時(shí)利用 HepG2、HUVEC-T1 和經(jīng) PMA 誘導(dǎo)的 THP-1 以及人類(lèi)肝臟星狀細(xì)胞建立了肝臟類(lèi)器官。使用高效液相色譜法測(cè)定 APAP 濃度，并使用 Phoenix 軟件通過(guò)非房室分析法擬合藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。肝臟損傷生物標(biāo)志物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的變化，以及肝臟功能標(biāo)志物白蛋白表明，這兩個(gè)器官芯片模型在 4 天內(nèi)的短期培養(yǎng)是穩(wěn)定的。在給藥對(duì)乙酰氨基酚（APAP）后，活性氧信號(hào)增強(qiáng)，同時(shí)線(xiàn)粒體膜電位降低，caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）被激活，p53 信號(hào)增強(qiáng)，表明 APAP 過(guò)量引發(fā)了毒性反應(yīng)。在腸肝臟多器官系統(tǒng)模型中，我們擬合了毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并模擬了 APAP 過(guò)量后的肝臟毒性過(guò)程，這將有助于器官芯片在藥物毒性檢測(cè)中的應(yīng)用。

1. 引言

藥物性肝臟損傷（DILI）是藥物研發(fā)的主要障礙，會(huì)導(dǎo)致藥物撤市（2021 年；2016 年）。動(dòng)物模型與人體之間的差異以及日益嚴(yán)格的倫理要求，使得有必要采用新的藥物安全性評(píng)估模型（2014 年）。這種微生理系統(tǒng)（MPS），也稱(chēng)為“芯片上的器官"，是一種通過(guò)結(jié)合微流控、微制造和三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的裝置。它能夠?yàn)閯?dòng)物模型重現(xiàn)生理相關(guān)的器官功能。MPS平臺(tái)是一種微型化的體外生理環(huán)境（Shinohara等，2021）。

這使得能夠模擬和精確控制化學(xué)梯度和生物力學(xué)力，以模擬體內(nèi)環(huán)境并響應(yīng)。預(yù)定義的微流控通道充當(dāng)工程化的血管，重現(xiàn)體內(nèi)生理組織功能（Low 等，2020 年），并允許與其他多器官系統(tǒng)聯(lián)合（Kulthong 等，2020 年）。此外，多器官系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)組織功能監(jiān)測(cè)（Milani 等，2022 年）。

由微流道串聯(lián)的多器官芯片模型能夠進(jìn)一步模擬人類(lèi)動(dòng)態(tài)反應(yīng)和內(nèi)部器官相互作用（Arakawa 等，2020 年），并為藥物暴露與藥物效果/毒性的關(guān)系提供輔助證據(jù)。腸和肝臟是主要的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）器官，因此在藥代動(dòng)力學(xué)（PK）研究中非常重要（Vernetti 等，2017 年）。

口服藥物通過(guò)消化道和腸直接吸收進(jìn)入血液，影響藥物的生物利用度和全身劑量。腸芯片模型可以模擬藥物吸收，并描繪藥物的 ADME 和血藥濃度（Milani 等，2022 年）。Lee 等（2017 年）建立了一個(gè)三維腸肝臟芯片來(lái)描繪對(duì)乙酰氨基酚（APAP）的藥代動(dòng)力學(xué)模型，而 Arakawa 等（2020 年）構(gòu)建了一個(gè)腸-肝臟模型，用于SAN唑侖的連續(xù)代謝的體外定量推算。Milani 等（2022 年）評(píng)估了由于腸和肝臟對(duì)麥考酚酯代謝而產(chǎn)生的藥物前體麥考酚酯的量。因此，類(lèi)似的方法可以應(yīng)用于其他多器官的 MPS，以研究人體內(nèi)的藥效學(xué)過(guò)程。

目前僅有少數(shù)關(guān)于同時(shí)進(jìn)行毒性檢測(cè)和樣本鑒定的多器官芯片系統(tǒng)的例子被報(bào)道。Liu等（2020 年）基于基于腸、血管、肝臟和腎臟芯片的多器官芯片系統(tǒng)研究了人參皂苷復(fù)合物 K 的吸收、代謝和毒性。Jeon等（2021 年）報(bào)道了一種腸肝臟芯片，重現(xiàn)了脂肪酸的吸收以及隨后在肝臟中的脂質(zhì)積累。

為了探索體外腸-肝臟的微生理系統(tǒng)，在此，我們通過(guò)將腸培養(yǎng)物與使用四種細(xì)胞系構(gòu)建的 3D 肝臟球體串聯(lián)在二聯(lián)器官芯片（2OC）上，開(kāi)發(fā)了一種可重復(fù)的腸-肝臟的二聯(lián)器官芯片。我們通過(guò)檢測(cè)功能生物標(biāo)志物和蛋白質(zhì)的水平來(lái)剖析芯片功能，然后在芯片中通過(guò)向腸腔室添加肝臟毒性化合物對(duì)乙酰氨基酚（APAP）來(lái)測(cè)試肝臟毒性，以模擬藥物吸收后的肝臟毒性。經(jīng)過(guò) 48 小時(shí)的孵育，檢測(cè)了兩個(gè)腔室中的藥物分布和肝臟毒性信號(hào)。

2. 材料和方法

2.1. 細(xì)胞與培養(yǎng) 細(xì)胞資源及培養(yǎng)方法見(jiàn)補(bǔ)充信息。

2.2. 腸的培養(yǎng)

為了在 Transwell 培養(yǎng)板上構(gòu)建腸模型，以 1 ×10-6 細(xì)胞/孔的密度將 Caco-2 細(xì)胞接種到 Transwell 培養(yǎng)板（默克公司，PIHP01250）中。將 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細(xì)胞以 9:1 的比例混合，并以相同的濃度接種到每個(gè)培養(yǎng)板中。從第 0 天到第 7 天，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，第 7 天之后每天更換一次。

2.3. 3D（肝臟）的培養(yǎng)

基于我們之前的研究（Sun 等，2024 年），THP-1 細(xì)胞在 RPMI 1640 培養(yǎng)基中稀釋至 5 ×10-5 細(xì)胞/毫升，然后用 25 納摩爾的佛波酯酰基乙酸（PMA，MedChemExpress）處理 48 小時(shí)，在 6 孔板中進(jìn)行。隨后在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 小時(shí)并用 TryplE（Gibco）進(jìn)行篩選，經(jīng) PMA 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞被收集。   2   HepG2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 T1、THP-1 以及人類(lèi)肝臟星狀細(xì)胞（HHSC）消化后收集，細(xì)胞懸液以 60:19:15:6 的比例混合。為了形成等量細(xì)胞，稀釋后每孔接種 100 個(gè)細(xì)胞到圓底 U 型低貼壁 96 孔板（深圳肝臟生物技術(shù)有限公司，LV-ULA002-96UW）中。每?jī)商旄鼡Q一半培養(yǎng)基。 使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析儀（珀金埃爾默公司，Opretta 系列）對(duì)球形形態(tài)進(jìn)行了觀(guān)察和測(cè)量。

2.4. 基于芯片的腸-肝臟共培養(yǎng)

HUMIMIC Chip2 24 孔板（德國(guó) TissUse GmbH）是按照推薦方案（Wagner 等，2013 年）制備的。在腸模型建立后的第 14 天，將 Transwell 細(xì)胞嵌體添加到 24 孔培養(yǎng)室中，并將 50 個(gè)球體添加到 96 孔培養(yǎng)室中，以形成腸-肝臟芯片模型。

根據(jù)之前的方法（Lin 等，2020 年），在2OC 微流道循環(huán)中，使用600 ul循環(huán)培養(yǎng)基和 400 ul位于屏障頂部的培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)。

肝臟腔室中的培養(yǎng)基每天更換一次，并且收集并更換一半的循環(huán)上清液。在 7 天共培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，使用免疫熒光法分析肝臟的器官特異性功能標(biāo)志物。將片上微流泵設(shè)置為 0.8 Hz的頻率。

2.5. 腸類(lèi)器官的完整性

在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量熒光素鈉和 40 kDa熒光異硫氰酸熒光素 - 葡聚糖的跨內(nèi)皮電阻（TEER）和腸表觀(guān)通透性系數(shù)（Papp），以評(píng)估腸類(lèi)器官的完整性。方法見(jiàn)補(bǔ)充信息。

2.6. 肝臟類(lèi)器官的性能評(píng)估

在肝臟模型中，選擇了一種靈敏的雙色熒光細(xì)胞活力測(cè)定法來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。使用鈣黃綠熒光素 AM（一種細(xì)胞可滲透染料）作為活細(xì)胞指示物，使用碘化 BOBO-3（Invitrogen 公司）作為死細(xì)胞指示物。活細(xì)胞成分在活細(xì)胞中產(chǎn)生強(qiáng)烈、均勻的綠色熒光（激發(fā)/發(fā)射 488 納米/515 納米），而死細(xì)胞成分主要產(chǎn)生細(xì)胞核紅色熒光（激發(fā)/發(fā)射 570 納米/602 納米）。 在使用建立的肝臟器官芯片模型獲得的上清液中測(cè)量了各種生物標(biāo)志物。我們?cè)u(píng)估了白蛋白（ALB）、尿素（UREA）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的水平，這些是肝臟代謝和損傷的指標(biāo)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 Cell Titor Glo 3D（Promega）測(cè)量了三磷酸腺苷（ATP）的含量。 膽酰基-賴(lài)氨酸-熒光素（CLF）是一種熒光素標(biāo)記的膽汁酸，其生物學(xué)行為與天然膽酰基甘氨酸非常相似。為了在三維肝臟模型中可視化膽管，我們制備了 20 微摩爾的 CLF 儲(chǔ)備液，并將模型在 37°C 下孵育 2 小時(shí)。用 Hoechst 33342 染色并孵育 10 分鐘。細(xì)胞用無(wú)酚紅培養(yǎng)基沖洗三次，并在激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為 498/517 納米處檢測(cè)熒光信號(hào)。

2.7. 形態(tài)學(xué)與免疫染色

如前所述（Sun 等，2024 年），腸和肝臟的等量切片用多聚甲醛固定，并用蔗糖溶液脫水。冷凍切片在染色前先用蘇木精-伊紅（HE）染色、高碘酸-希夫（PAS）染色或免疫染色進(jìn)行切割。對(duì)于免疫染色，切片先用 PBS 沖洗三次     用含有 0.5% Triton X-100（索爾博）的 PBS 處理細(xì)胞，處理時(shí)間及穿孔處理 10 分鐘，用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封閉 30 分鐘，在室溫下進(jìn)行。按照說(shuō)明書(shū)以一定稀釋度向每個(gè)孔中加入一抗原位體，并在 4℃下孵育過(guò)夜。使用以下一抗原位體：抗 Occludin（91131S，CST，1:400 稀釋度）、抗 ZO-1（ab221547，Abcam，1:100 稀釋度）、抗 MRP2（ab172630，Abcam，1:500 稀釋度）和抗 PGP（貨號(hào) 25081-2-AP，ProteinTech，1:500 稀釋度）。清洗細(xì)胞，用相應(yīng)的熒光偶聯(lián)二抗原位體處理，并與 DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析儀或顯微鏡（奧林巴斯 IX71）觀(guān)察明視野形態(tài)和切片。 對(duì)于原位免疫熒光染色，腸膜和 3D 肝臟模型用 PBS 沖洗三次，并用 4%多聚甲醛固定 30 分鐘。接下來(lái)，樣本在含有 0.5% Triton X-100（索爾博）的 PBS 中穿孔處理 10 分鐘，并在室溫下用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封閉 30 分鐘。 按照說(shuō)明書(shū)，將稀釋后的原位抗體以一定稀釋度加入每個(gè)孔中，并在4℃下孵育過(guò)夜。使用的原位抗體包括：抗Occludin（91131S，CST，1:400稀釋?zhuān)⒖筞O-1（sc-33725，Santa Cruz Biotechnology，1:500稀釋?zhuān)⒖筂RP2（ab172630，Abcam，1:500稀釋?zhuān)⒖笰BCB11/BSEP（ab255605，Abcam，1:100稀釋?zhuān)⒖筆GP（Cat No. 25081-2-AP，ProteinTech，1:500稀釋?zhuān)⒖笴YP3A4（MA5-17064，ThermoFisher，1:1000稀釋?zhuān)⒖筀i67（9449S，CST，1:10,000稀釋?zhuān)⒖笴D31（3528S，CST，1:100稀釋?zhuān)⒖笴D68（ab213363，Abcam，1:100稀釋?zhuān)⒖筍MA（14395-1-AP，ProteinTech，1:100稀釋?zhuān)⒖沽呀獾腸aspase-3（9664S，CST，1:400稀釋?zhuān)┖涂筽53（2524S，CST，1:2000稀釋?zhuān)＜?xì)胞經(jīng)過(guò)洗滌，與熒光偶聯(lián)的次級(jí)抗體孵育，并與DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用的次級(jí)抗體包括：山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150077，Abcam，1:1,000稀釋?zhuān)⑸窖蚩故驣gG（H + L）（Alexa Fluor® 555 Conjugate）（4417，CST，1:1000稀釋?zhuān)┖蜕窖蚩剐∈驣gG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150113，Abcam，1:1,000稀釋?zhuān)＝Y(jié)果通過(guò)高含量分析和熒光顯微鏡進(jìn)行評(píng)估。

2.8. 藥物毒性和細(xì)胞活力測(cè)定

如前所述（Sun 等，2024 年），使用 Cell Titor Glo 檢測(cè)細(xì)胞活力，并測(cè)定細(xì)胞存活率和細(xì)胞存活率（%）。在 96 孔板中，以 1 ×10-4細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種到 96 孔板中；次日丟棄上清液，并與對(duì)乙酰氨基酚（4 毫摩爾）一起培養(yǎng)。使用同樣的方法測(cè)定球體的存活率。該檢測(cè)使用光度計(jì)進(jìn)行。

2.9. 阿司匹林在共培養(yǎng)芯片中的模擬口服過(guò)程

加載了 7 個(gè) 2OC 模型，其中 4 個(gè)微流道給藥對(duì)乙酰氨基酚（APAP），其余回路未給予。為了模擬口服過(guò)程以及 APAP 誘導(dǎo)的肝臟毒性后果，在加載 2OC 回路后的第二天，向插入物頂部加入 400 微升 10 毫摩爾的 APAP。在 0、0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小時(shí)分別收集 10 微升上清液用于液相色譜定量分析。在給藥 48 小時(shí)后，收集上清液用于各種生物標(biāo)志物的測(cè)量以評(píng)估透皮電阻（TEER）。同時(shí)收集肝臟球體用于肝臟毒性評(píng)估。我們還至少收集了 3 - 5 個(gè)用于細(xì)胞活力測(cè)定，其余部分轉(zhuǎn)移到 96 孔板中保存以用于熒光染色。

2.10. 共培養(yǎng)芯片的肝臟毒性評(píng)估

根據(jù)推薦的試劑盒方案，測(cè)量細(xì)胞活力以及白蛋白（ALB）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平，以評(píng)估藥物給藥 48 小時(shí)后的肝臟損傷情況。使用線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（Beyotime Biotechnology，C2001S）進(jìn)行測(cè)定線(xiàn)粒體膜電位。將 2OC 芯片的 3D 包埋肝臟模型轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。分別在 Ex/Em = 550/575 和 350/461 納米檢測(cè)四甲基羅丹明乙酯（TMRE）和 Hoechst 33342 的熒光信號(hào)。使用 CellROX 氧化應(yīng)激試劑（賽默飛世爾科技，C10444）測(cè)定氧化應(yīng)激。 將 2OC 芯片的 3D 嵌入式肝臟模型轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。分別在 485/520 納米和 350/461 納米檢測(cè) CellROX 和 Hoechst 33342 的熒光信號(hào)。使用免疫熒光染色法檢測(cè)原位 Ki-67、裂解的 caspase-3 和 p53 信號(hào)，以評(píng)估細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡情況。

2.11. 樣本定量

基于之前的方法（Marin 等，2019 年），使用高效液相色譜法（HPLC）（島津，LC-2040C 3D）測(cè)量對(duì)乙酰氨基酚（APAP）的濃度。基底側(cè)腔室（肝臟腔室）用新鮮培養(yǎng)基填充，而頂側(cè)腔室暴露在對(duì)乙酰氨基酚培養(yǎng)基中。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，如第 2.9 節(jié)所述，從兩側(cè)各取 10 微升樣本。選擇甲醇作為蛋白質(zhì)沉淀劑，在加入 30 微升甲醇以沉淀蛋白質(zhì)后，通過(guò)離心機(jī)（13000 轉(zhuǎn)/分鐘，4℃，15 分鐘）去除沉淀物。使用惰性可持續(xù) C18（150 毫米長(zhǎng)度，內(nèi)徑 4.6 毫米，粒徑 5 微米，島津）色譜柱。使用兩種流動(dòng)相：溶劑 A（甲醇）和溶劑 B（蒸餾水），流速為 0.8 毫升/分鐘。溶劑組成在 0 - 4 分鐘為 5% A，4.01 - 10 分鐘為 5 - 100% A，10.01 - 15 分鐘為 5% A。進(jìn)樣量為 10 微升，檢測(cè)使用光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器（波長(zhǎng) 280 納米）。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚的濃度。 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用非房室模型（NCA）在 Phoenix WinNonlin（Certara，美國(guó)）中進(jìn)行擬合。采用線(xiàn)性梯形線(xiàn)性插值法作為計(jì)算方法，模型類(lèi)型定義為血漿，劑量選項(xiàng)定義為血管外。通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定的肝臟隔室中的對(duì)乙酰氨基酚（APAP）濃度 - 時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以確定 0 至 48 小時(shí)下的曲線(xiàn)下面積（AUC）。峰值濃度（Cmax）和達(dá)峰時(shí)間（Tmax）直接從個(gè)體濃度與時(shí)間曲線(xiàn)中讀取（高等，2022 年；王等，2022 年）。 采用超高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS）檢測(cè) NAPQI 的信號(hào)（張等，2018 年）。通過(guò)將 N-乙酰基對(duì)苯二酚亞胺（NAPQI）（MCE，HY-66005）溶解在甲醇中制備濃度為 1 毫克/毫升的儲(chǔ)備溶液，并用甲醇進(jìn)一步稀釋至 1 微克/毫升的工作溶液。對(duì) NAPQI 的形成進(jìn)行了分析。 在服用對(duì)乙酰氨基酚（APAP）后 0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小時(shí)，使用配備 AB SCIEX LC AC 系統(tǒng)、PDA 檢測(cè)器和三重四極桿 6600+儀器的超高效液相色譜 - 質(zhì)譜法（UPLC-MS）進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)使用沃特斯 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 毫米×50 毫米）實(shí)現(xiàn)了色譜分離。 1.7 微米）。使用的洗脫液為（A）0.1%（體積比）的甲酸水溶液和（B）甲醇，采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離，如表S1所示。超高效液相色譜流速為0.3 mL/min，超高效液相色譜-質(zhì)譜分析使用10 微升樣品。對(duì)應(yīng)于解聚電位、碰撞能量、碰撞能量分布和溫度的離子對(duì)特征為m/z 149.98-108.04（30、30、15和350），對(duì)應(yīng)于NAPQI。

2.12. 統(tǒng)計(jì)分析

連續(xù)變量以均值±偏差（標(biāo)準(zhǔn)差）表示。采用雙尾學(xué)生 t 檢驗(yàn)來(lái)研究?jī)蓚€(gè)獨(dú)立樣本之間的差異。數(shù)據(jù)分析使用 IBM SPSS Statistics 25 版（IBM 公司）進(jìn)行。線(xiàn)性回歸模型使用 SPSS 和 GraphPad Prism 7.00（GraphPad 軟件）進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義設(shè)定為 P≤0.05。

3. 結(jié)果

3.1. 類(lèi)器官的培養(yǎng)

將細(xì)胞混合物以 1 ×10-6、5 ×10-5 和 2.5 ×10-5 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到 Transwell 培養(yǎng)板中，以獲得體外腸模型。所有組的跨上皮電阻（TEER）在 21 天內(nèi)均達(dá)到 300 Ω cm2，其中高密度共培養(yǎng)組在 12 天內(nèi)達(dá)到 300 Ω cm2（圖 1A）。在第 14 天，高密度共培養(yǎng)組模型中熒光素鈉和熒光素葡聚糖均符合滲透性測(cè)試要求（圖 1B）。當(dāng)跨上皮電阻達(dá)到 200 - 1000 Ω cm2 時(shí)，Caco - 2 單層可被視為完整（Iftikhar 等，2020 年）。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇高密度共培養(yǎng)組來(lái)形成腸屏障。 緊密連接蛋白 Occludin 和 ZO-1 經(jīng)過(guò)染色，以顯示其在腸等值物培養(yǎng)條件下的完整性。在第 7 天和第 21 天，我們觀(guān)察到 Occludin 的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖 1C），而在第 14 天和第 21 天的切片中，Occludin 和 ZO-1 呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖 1D，圖 S1A），表明在第 14 天腸屏障被視為完整的。在第 14 天和第 21    天，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MRP2 和 PGP 分布在腸切片的一側(cè)（圖 1E，圖 S1B），表明腸模型的極性。總體而言，結(jié)果表明在第 14 天獲得的腸等值物具有緊密連接和極性；因此，在第 14 天腸屏障被視為成熟的，并用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。 在圖 2A 中，模型的直徑在 10 天內(nèi)迅速增大，并穩(wěn)定在約 400 微米。HE 染色顯示在第 7 天（圖 2B）沒(méi)有明顯的壞死核心，但在第 10 天（圖 2B）有輕度壞死核心或幾個(gè)細(xì)胞凋亡，在第 14 天（圖 S1I）有嚴(yán)重的中心壞死區(qū)域。與活/死細(xì)胞染色（圖 2C）所示的死細(xì)胞分布一致，在第 10 天檢測(cè)到更多的死細(xì)胞。模型中 ATP 的總量持續(xù)增加（圖 S1C），而乳酸脫氫酶（LDH）的分泌沒(méi)有顯著增加（圖 S1D）。模型穩(wěn)定生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，壞死細(xì)胞數(shù)量增加，通過(guò)檢測(cè)上清液中的 LDH 水平無(wú)法檢測(cè)到內(nèi)部壞死細(xì)胞。為避免壞死細(xì)胞核的形成，這些結(jié)果表明培養(yǎng)時(shí)間限制為 7 天。 在第 7 天（圖 2D）和第 10 天，分別通過(guò) CD31、CD68 和α-SMA 信號(hào)來(lái)追蹤人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 T1（HUVEC-T1）、人肺泡巨噬細(xì)胞 THP-1 和人肝臟星狀細(xì)胞 HHSC 的熒光信號(hào)，采用免疫熒光染色法進(jìn)行追蹤。

圖 S1G 表明，上述三種細(xì)胞類(lèi)型在第 10 天仍存在于球體中。在第 7 天檢測(cè)了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MRP2、PGP 和 BSEP（圖 2E），并通過(guò)熒光探針 CLF 追蹤了膽汁酸外排的功能（圖 S1H）。CLF 是 MRP2 和 BSEP 的底物（Boaglio 等，2010 年），CLF 信號(hào)也表明了這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在類(lèi)器官中的功能。   最后，PAS 染色顯示有糖原沉積（圖 2B），ALB 和 UREA 的增加趨勢(shì)表明，即使在細(xì)胞死亡緊急情況下，肝臟的總合成代謝功能也未受阻礙（圖 S1E - F）。這些結(jié)果表明，在 14 天內(nèi)，類(lèi)器官對(duì)肝臟功能的影響相對(duì)穩(wěn)定。

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